เพาะเชื้อราอย่างไร..ให้ได้ผลไวและแม่นยำ

• 25 พ.ค. 2020

โรคผิวหนังที่พบในสุนัขและแมว บางครั้งก็มีลักษณะอาการที่คล้ายคลึงกันกับโรคผิวหนังชนิดอื่น เช่น โรคติดเชื้อจากการแพ้ โรคผิวหนังจากขี้เรื้อนแห้งและเปียก หรือ โรคผิวหนังที่เกิดจากฮอร์โมนผิดปกติ การตรวจวินิจฉัยแยกแยะให้กับการติดเชื้อราผิวหนังจะทำให้สามารถวางแนวทางการรักษาได้อย่างแม่นยำและใช้เวลาในการรักษาได้อย่างมีประสิทธิภาพ รวมทั้ง ปลอดภัยต่อการเลือกใช้ยาต่างๆเพื่อการรักษาที่อาจส่งผลต่อสุขภาพของสัตว์เลี้ยงอีกด้วย

เก็บตัวอย่างที่เหมาะสมเป็นจุดเริ่มต้นของความสำเร็จ (COLLECTING SAMPLES FOR CULTURE)

Hair pluck

         การถอนขนทั้งเส้นจากบริเวณที่สงสัยการติดเชื้อมาเพาะหาเชื้อราบนเจลอาหาร ต้องใช้อุปกรณ์ที่ปลอดเชื้อ (sterile) เท่านั้น โดยเลือกเก็บจากบริเวณขอบของรอยโรคที่เกิดขึ้นใหม่ หรือ บริเวณที่รอยโรคกำลังกระจายตัวออก โดยหลีกเลี่ยงบริเวณที่มีการใช้ยาทาเพื่อรักษามาก่อน เส้นขนที่ดีที่ใช้เพื่อการเพาะเชื้อราคือ เส้นขนที่ปรากฏความผิดปกติให้เห็น เช่น เก็บจากบริเวณที่มีสะเก็ดรังแคมากเป็นพิเศษ เส้นขนที่เสียหาย และ ผิดรูปร่าง

Toothbrush technique

        เส้นขนที่เลือกถอนมาเป็นตัวอย่างสำหรับเพาะเชื้ออาจมีโอกาสเป็นเส้นขนตัวอย่างที่ไม่ดีหรือไม่เหมาะสมที่จะให้เชื้อที่มากพอจะเจริญบนเจลอาหาร ดังนั้น การเลือกใช้วิธี “the Mackenzie brush technique” คือการใช้แปรงสีฟันใหม่ที่เพิ่งแกะออกจากห่อเก็บตัวอย่างจากหลายๆบริเวณจะให้ปริมาณของเชื้อราได้มากกว่าการถอนขนเป็นเส้นๆ ด้วยการแปรงเบาๆให้ทั่วบริเวณที่สงสัยรวมทั้งบริเวณผิวหนังและเส้นขนที่แสดงอาการขนร่วงหรือมีสะเก็ด

          เทคนิคนี้ช่วยให้สามารถตรวจหาการติดเชื้อที่ไม่แสดงอาการหรือรอยโรคที่เห็นไม่ชัดเจนได้ดี โดยเฉพาะสัตว์ที่เป็นพาหะของโรคเชื้อราหรือสัตว์ที่กำลังได้รับการรักษาอยู่ โดยสัตว์ในกลุ่มนี้แนะนำให้แปรงไปทั่วทั้งตัว เน้นที่บริเวณที่เคยมีรอยโรคมาก่อนที่จะได้รับการรักษา และกรณีแมวให้เน้นที่หน้า, ใบหูและอุ้งเท้า  ปัดแปรงไปทั่วให้ได้ประมาณ 1 นาที หรือ ปัดแปรงตลอดความยาวของตัวสัตว์ 10 ครั้ง

Note:

     - ในสัตว์ที่กำลังได้รับยาเพื่อรักษาเชื้อราอยู่ ให้เพาะเชื้อซ้ำเพื่อติดตามการรักษาทุก 2-3 สัปดาห์ และให้ยาเพื่อรักษาต่อเนื่องจนกว่าผลเพาะเชื้อราจะเป็น Negative ต่อกัน 2 ครั้ง

     - ทำความสะอาดเล็บและบริเวณที่จะเก็บตัวอย่างด้วยแอลกอฮอลก่อนที่จะเก็บทุกครั้ง เพื่อช่วยลดการสะสมของ saprophytic หรือเชื้อราที่พบได้ตามสิ่งแวดล้อมทั่วไปก่อน

     - แปรงสีฟันที่ใช้สามารถหาซื้อได้ทั่วไป แปรงที่ใช้แล้วไม่ให้ใช้ซ้ำ แต่ สามารถฆ่าเชื้อด้วยการอบแก๊สเพื่อใช้ซ้ำได้

อาหารเพาะเลี้ยงและการดูแลเพื่อให้ได้เชื้อราเพื่อวินิจฉัยโรค   (SELECTING AND INCUBATING CULTURE MEDIA)

          เจลอาหารชนิด Dermatophyte test medium(DTM) คือ Sabouraud's dextrose agar ที่เติมสารเพื่อยับยั้งการเติบโตของเชื้อราและแบคทีเรียที่เราไม่ต้องการให้มารบกวนการเติบโตของเชื้อรากลุ่ม Dermatophyte ที่เราต้องการ (เช่น cycloheximide, gentamicin, และ chlortetracycline) รวมทั้งเติม pH indicator (phenol red) เพื่อให้เราสามารถเห็นการเปลี่ยนโปรตีนในเจลอาหารให้เป็นด่างของ Dermatophyte ได้ง่ายจากสีของเจลอาหารที่เปลี่ยน

         ภาชนะเจลอาหารแบบจานเพาะ(plate, Petri dish) จะเหมาะกว่าภาชนะแบบหลอด(vial) เนื่องจากหลอดจะมีทางเข้าที่แคบมากทำให้การเก็บตัวอย่างด้วยแปรงสีฟันทำได้ยาก รวมทั้งการนำโคโลนีของเชื้อราออกมาทดสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ก็ทำได้ยากเช่นกัน เพื่อให้การตรวจสอบและวินิจฉัยแยกแยะชนิดของเชื้อราได้สะดวก    

         คำแนะนำเรื่องการเก็บรักษาจากผู้ผลิตเจลอาหารเพาะเชื้อราจะแตกต่างกันไปแล้วแต่บริษัท โดยจะแนะนำให้เก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ 2 ถึง 25 องศาเซลเซียส และ เก็บให้พ้นแสงก่อนที่จะนำมาใช้งาน เมื่อจะใช้งานต้องนำมาปรับให้อยู่ในอุณหภูมิ 25 ถึง 30 องศาเซลเซียสก่อน และเมื่อทำการเพาะเชื้อแล้วให้แยกเก็บเจลอาหารนี้ออกจากสิ่งแวดล้อมทั่วไปมากที่สุด  ไม่ควรใช้เมื่อหมดอายุหรือพบว่าเจลอาหารแห้ง แตก เปลี่ยนสี หรือพบว่ามีการปนเปื้อนของเชื้อที่ไม่พึงประสงค์ และหากเก็บในภาวะที่ร้อนเกินกว่าที่แนะนำไว้จะพบว่าเจลอาหารมีการจับตัวแน่นแข็ง

       เชื้อราจะเจริญได้ที่อุณหภูมิ 25 ถึง 30 องศาเซลเซียส และมีความชื้น 30% หากอุณหภูมิในห้องไม่คงที่แนะนำให้ใช้ incubator, หรือส่งตัวอย่างไปให้กับห้องปฏิบัติการที่มีความพร้อมแทน

       เชื้อส่วนใหญ่จะปรากฎเฉลี่ยใน 7 ถึง 10 วัน แต่อย่างน้อยควรเก็บเจลอาหารเพาะเชื้อไว้ที่ 21 วัน เพื่อให้แน่ใจว่าตัวอย่างที่ได้จากสัตว์ที่กำลังอยู่ในระหว่างการรักษายังมีการติดเชื้ออยู่หรือไม่ เนื่องจากอาจจะให้เชื้อราที่มากับตัวอย่างน้อยกว่าสัตว์ที่ยังไม่ได้รับการรักษา และบางผู้ผลิตอาจจะมีแนะนำการเก็บเจลอาหารหลังการเพาะเชื้อที่ต่างกัน บางแห่งให้รับแสงได้ บางแห่งให้เก็บในห้องมืดเพื่อลดปัญหาที่แสง UV จะรบกวนการเติบโตของเชื้อรา และในพื้นที่ที่มีอากาศแห้ง(dry climates) แนะนำให้ใส่เจลอาหารที่เพาะเชื้อไว้ในถุงพลาสติกเพื่อลดการสูญเสียความชื้นซึ่งอาจจะทำให้เพาะเชื้อไม่ขึ้นได้ และหลังจากการเพาะเชื้อราได้ 48 ถึง 72 ชั่วโมง ให้เริ่มการสังเกตุการเปลี่ยนแปลงแบบรายวันของสีเจลอาหาร และ โคโลนีของเชื้อ

ต้องแยกชนิดของเชื้อราทุกครั้งทั้งเพื่อยืนยันผลการวินิจฉัยและจัดการรักษาให้ได้ประสิทธิภาพสูงสุด IDENTIFYING DERMATOPHYTES

      การวินิจฉัยแยกแยะชนิดของเชื้อราผิวหนัง เราต้องใช้การพิจารณาร่วมกันทั้ง  morphology ของโคโลนีที่เราเห็นด้วยตาเปล่า หรือ Macroscopic Finding เช่น  Microsporum และ Trichophyton species ซึ่งเป็นเชื้อราผิวหนังที่พบได้มากที่สุดในสุนัขและแมวจะมีโคโลนีสี white, light yellow, tan, หรือ buff-colored cottony-to-powdery-appearing colonies โดยที่ Dermatophyte จะไม่เป็นสี black, green, หรือ gray

         เนื่องจากเชื้อราผิวหนังในสัตว์สามารถติดต่อสู่คนได้ การวินิจฉัยแยกแยะใต้กล้องจุลทรรศน์จึงจำเป็นต้องสวมถุงมือเพื่อป้องกันสปอร์ของเชื้อราทุกครั้ง ใช้เทปใสแตะบนโคโลนีของเชื้อราบนเจลอาหารเบา ๆ และนำมาแปะบนสไลด์ที่หยดสารย้อมสีฟ้า(เช่น methylene blue, lactophenol cotton blue, หรือ the blue Diff-Quik solution [basophilic thiazine dye])เอาไว้ 1 หยด และตรวจดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ ใช้กำลังขยาย 100X ถึง 400X เพื่อหาและดูรายละเอียดของ macroconidia 

  Microscopic dermatophyte characteristics

           สปอร์ของ Microsporum canis มีขนาดใหญ่ ผนังหน้า ข้างในแบ่งออกเป็นช่อง (cells) ตั้งแต่ 6 ช่องขึ้นไปและรูปร่างคล้ายกระสวย (large, spindle-shaped, and thick-walled with six or more internal cells)และมักพบ terminal knob ถ้าหากวินิจฉัยได้ว่าเป็นการติดเชื้อ M. canis สัตว์เลี้ยงทุกตัวในบ้างต้องได้รับการทดสอบเพื่อหาการติดเชื้อด้วยการเพาะเชื้อรา ทั้งหมดเพื่อหาว่าสัตว์ตัวใดเป็นพาหะที่ไม่แสดงอาการ และสัตว์ที่ได้รับการวินิจฉัยเป็น Positive ทุกตัวต้องได้รับการรักษาด้วยยารักษาเชื้อราที่ใช้ภายนอก โดยอาจจะร่วมหรือไม่ร่วมกับยากินก็ได้ และให้แยกกลุ่มสัตว์ที่ positive ออกไปจากกลุ่ม negative ให้มากที่สุดที่เป็นไปได้

             Microsporum gypseum สร้างสปอร์คล้ายกระสวยขนาดใหญ่ ผนังบาง ไม่มี terminal knob, และมีช่อง (cells) น้อยกว่า 6 ช่อง

            Trichophyton mentagrophytes สร้าง macroconidia ที่มีผนังบางและรูปร่างยาวคล้ายซิการ์ (cigar-shaped) รวมทั้งสามารถพบสาย Spiral-shaped hyphae และ microconidia คล้ายพวงองุ่นจำนวนมากได้ ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของเชื้อรากลุ่ม Trichophyton species

บทความโดย 

สพ. ญ. พิชญาภา ชมแก้ว

..........................................................................................................................................................................................................

เอกสารอ้างอิง

Coyner, K. S. (2010, July 1). How to perform and interpret dermatophyte cultures.

Retrieved from https://www.dvm360.com/view/how-perform-and-interpret-dermatophyte-cultures

รูปภาพ

Figure 1. วิธี The Mackenzie brush technique ใช้เพื่อเก็บตัวอย่างสำหรับเพาะเชื้อรา

Figure 2. กดแปรงเบาๆลงบนเจลอาหารเพาะเชื้อ

Figure 3. จานเพาะเชื้อราที่มี Microsporum canis เจริญอยู่ (จะเห็นโคโลนีสีขาวถึงเหลืองซีดที่บนสุดของจานเพาะ) กำลังถูกบดบังด้วยเชื้อรา saprophytic สีเทาที่ด้านใต้ การสังเกตุจานเพาะเชื้อราทุกวันไม่ว่าจะพบหรือไม่พบเชื้อราที่สงสัยก็ตาม รวมทั้งการแยกเชื้อราที่สงสัยไปเพาะเพิ่มเติมบนเจลอาหารใหม่ จะช่วยให้มั่นใจได้ว่าเชื้อรากลุ่ม saprophytes จะไม่มาเจริญเติบโตจนบดบังเชื้อรา dermatophytes ซึ่งอาจก่อให้เกิดการวินิจฉัยผิดพลาดได้ (false negative)

Figure 4. เชื้อราผิวหนังชนิด Trichophyton mentagrophytes สร้างโคโลนีที่มีสีขาวครีมเหมือนแป้ง แต่จานเพาะเชื้อราในภาพถูกเก็บรักษาไว้ในความชื้นที่ไม่เพียงพอ ทำให้เนื้อเจลอาหารแตกและแยกออกทางด้านขวา

Figure 5. ใช้เทปใสแตะด้านบนของโคโลนีเพื่อเก็บตัวอย่างสำหรับ microscopic fungal identification และนำมาแปะบนสไลด์ที่หยดสารย้อมสีฟ้าเตรียมไว้แล้ว

Figure 6. ภาพ macroconidia และสาย hyphae ของ Microsporum canis (Diff-Quik, 400X).

Figure 7. Microsporum gypseum มี macroconidia จำนวนมากที่ไม่มี terminal knob และมีผนังที่บาง รวมทั้งมีปริมาณของช่อง (cells) ที่น้อยกว่า M. canis (Diff-Quik, 400X).

Figure 8. Trichophyton mentagrophytes สร้าง macroconidia จำนวนไม่มากนักและมีรูปร่างเหมือนซิการ์ (cigar-shaped) แต่จะพบ microconidia เป็นจำนวนมากมาย (Diff-Quik, 400X).

Figure 9. Spiral hyphae เป็นลักษณะที่พบได้บ่ยของเชื้อรา T. mentagrophytes (Diff-Quik, 400X).

.........................................................................................................................................................................................................

Share this entry